上海銘博生物實驗室介紹：細胞免疫治療的監控細胞樣本

上海銘博生物實驗室介紹：細胞免疫治療的監控細胞樣本制備開始

一次完整的流式細胞分析包括：細胞樣本制備，流式細胞儀操作和數據分析。細胞樣品制備在流式分析過程中的重要性毋庸置疑，直接影響數據的準確度及實驗的整體進展。然而傳統細胞樣本制備過程中，離心可能對細胞造成諸多缺陷，例如：對細胞造成擠壓和破壞；不可控的細胞丟失使得原始樣本中的細胞群比列產生偏差，導致數據嚴重失真，讓研究者可能得到不客觀的數據分析和診斷結果，此外，傳統離心法還顯著受到操作者差異性的影響，并且需要消耗大量的人力和物力。

因此，想要獲得更加科學的實驗數據，邁入可定量、可重復性的流式細胞分析新境界，提升細胞制備過程是關鍵所在。

DA-Cell微滴陣列樣品前處理系統作為新一代樣品前處理系統，利用重力與層流的效應，可以在不用離心的情況下用非常輕柔和科學的方式實現對細胞，微珠等懸浮樣品的清洗操作。其在細胞制備過程中展現出來的優勢，是目前傳統離心方法所*的。
                 
Adicet Bio是一家專注于細胞免疫治療研發的公司，在 2016年與再生元(Regeneron Pharmaceuticals)簽訂了一項長達5年的合作協議，旨在實體腫瘤和血液腫瘤等多個項目開展合作(包括同種異體細胞療法)。為了能夠接合并殺死腫瘤細胞，Adicet Bio正在開發基于γδT細胞的工程化嵌合抗原受體(CAR)和T細胞受體(TCR)，以特異性靶向細胞內外抗原，為多種血液腫瘤和實體腫瘤提供多元化的臨床候選產品。

γδT細胞(ICP)產品在體外制備過程包括以下步驟：
1. 從健康捐贈者身上分離提取γδT細胞
2. 對γδT細胞進行基因改造
3. γδT細胞擴增
4. 擴增后的γδT細胞產品存入細胞銀行，以備后續使用

圖1. γδT細胞產品體外制備流程

Adicet Bio公司于第2, 3, 4步驟采用基于流式細胞術的分選方案對不同的捐贈者進行樣本選擇和質控，以確保后續用于治療的產品符合要求。γδT在人體血液中的含量非常低，如果在樣本制備過程中捐贈者的細胞丟失嚴重，可能會導致研究人員對結果誤判。為了避免這種情況，并獲取到更真實和科學的流式數據，挑選到合適的樣本，Adicet Bio公司研究人員在分選方案的細胞樣本制備過程中使用了DA-Cell微滴陣列樣品前處理系統。

圖2.  捐贈者的樣本含有不同比例的γδT細胞

圖3. 基于流式細胞術的樣本分選方案

結果一：DA-Cell可提升流式數據質量
高質量的流式細胞數據可以幫助研究人員正確分選捐贈者樣本和質控，減少因假陽性結果產生的誤判。



結果二：DA-Cell使實驗重復性高
DA-Cell自動化程度高，避免了人工操作的誤差，極大的提升了實驗的可重復性，即使樣本稀有，也可獲得較高的重復性。



結果三：：DA-Cell的數據穩定性程度高
細胞樣本無論經過DA-Cell幾次處理，細胞亞群的比例保持一致，避免數據出現偏差。



結果四：DA-Cell節省大量時間
DA-Cell 自動化程度高，僅需要傳統離心方法的10-20%的時間，從而提升實驗效率。


總結

DA-Cell 微滴陣列樣品前處理系統了傳統的離心方式，其原理是利用重力和流體力學的層流效應，在非離心的情況下，用非常輕柔和科學的方式實現對細胞、微珠等懸浮樣品的清洗操作。與傳統的離心方式下相比，DA-Cell 展現了巨大的優勢：

1. 杜絕因傳統離心法造成的數據偏差、得到更加科學的結果
由于不同細胞的大小、密度、形態等各不相同，它們在傳統離心法處理過程中丟失的比例各不相同，保留的比例已經偏離原始的真實值，會導致結果的偏差、甚至錯誤。而 DA-Cell 方法細胞丟失很少，可地保留原始的細胞比例，有助于得到更加真實、科學的結果。


△   傳統離?法只保留20-30%細胞樣品，DA-Cell可保留95%以上的細胞樣品
△   相較傳統離??式，DA-Cell可呈現更強的熒光訊號與完整細胞形態
△   離?過程對細胞所造成的擠壓會嚴重影響細胞的?理功能與蛋?表達


2. 節省時間、提升效率和通量



傳統離心與DA-Cell方法制備細胞樣本流程比較

傳統離心法每次清洗都有多個步驟，包括：加液、重懸、離心、去上清等，如果清洗 2-4 次就需要 20-40 分鐘，而 DA-Cell 方法則僅需要 2-6 分鐘，僅需要傳統方法10-20%的時間。

3. 樣品處理過程非常溫和，杜絕壓力和細胞破損

傳統細胞、微珠等懸浮樣品的制備都必須通過離心，離心力達到數百 g 或數千 g（即細胞需要承受相當于自身重量的數百或數千倍的壓力），這對細胞狀態的影響極大，甚至產生破碎；而 DA-Cell 僅利用細胞自身的重力和流體力學的層流效應既可以實現對樣品的制備過程，對細胞沒有任何脅迫，所以可以顯著減少細胞破損。


△   比較PBMC樣品經過4X的DA-Cell處理 vs 4X的離心處理對細胞活率的影響
△   DA-Cell在活細胞的比率上顯著高過傳統離心法
△   數據顯示傳統離心法相較DA-Cell容易造成更多的細胞損傷，甚至細胞死亡

4. 減少細胞脅迫、保持原始的蛋白和生物標志物表達水平
減少細胞脅迫、保持原始的蛋白和生物標志物表達水平傳統離心的方式會對細胞等懸浮樣品產品大量脅迫，這會影響很多基因的表達水平，并終很可能影響科學家所要觀察的蛋白和生物標志物，從而產生有偏差的數據。DA-Cell 微滴陣列樣品前處理系統對細胞的壓力和干擾很小，可以降低對蛋白和生物標志物表達水平的干擾。

△   數值為正數代表染色指數較高，使用DA-Cell后，蛋白染色度相對增加
△   有效觀測蛋白和生物標志物，實驗結果更加直觀

5. 提升流式分析數據結果
DA-Cel可以在不用離心的情況下用非常輕柔和科學的方式實現對細胞進行清洗，所獲得的數據即使進行多色流式分析，也可以輕易得到可靠的細胞分群結果。


樣品分別在傳統離心法與DA-Cell處理過后，在16色熒光流式分析的比較
△   HSC/iNKT ：DA-Cell因可減少細胞與訊號的丟失，可讓實驗者看到稀有細胞亞群，傳統離?法則無
△   GDT/MAIT：DA-Cell可顯著的提升細胞亞群間界線，傳統離?法就因過多細胞碎?易造成區分困難

6. 全自動操作、更好的可重復性、避免人工導入的偏差

傳統離心法的人工因素很多，由于不同人的操作手法不一樣、同一個人在不同時間的操作手法也難以保持一致，因此實驗可重復性較差；而 DA-Cell 是全自動操作，避免人工導入的誤差，可極大提升實驗的可重復性。

魔鬼藏在細節里，細節決定成敗，DA-Cell可在細胞處理的細節上改善數據的質量，使流式細胞分析邁入可定量，可重復性的新境界，從而提升細胞免疫治療的監控，